Exonuclease III 是一种核酸外切酶，该酶作用于双链 DNA，从 3'-OH 末端方向逐步切去单核苷酸。该酶最适底物是平末端或 5' 末端突出的 DNA，但也可以作用于双链 DNA 切刻位点产生单链缺口。由于对单链 DNA 无活性，因此该酶难以切割 3' 突出末端。3' 到 5' 外切酶活性对底物的消化程度随 3' 突出末端的长度而变化，四碱基或更长的突出末端难以被切割。这种特性可以用于生产特定方向的单链 DNA，将线性化 DNA 设计成为一端为不切割末端（3' 突出端），另一端则设计为易切割末端（平端或 5' 突出端），此时 Exonuclease III 将仅消化一条链。 Exonuclease III 也有 RNase H、3'- 磷酸酶和脱嘌呤 / 嘧啶 - 核酸内切酶活性。