【产品简介】
T4 Polynucleotide Kinase（简称T4 PNK），中文名称T4多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5'-羟基激酶，能够催化ATP的γ-磷酸基团转移到寡核苷酸链（双链或单链DNA或者RNA）或3'-单磷酸核苷上的5'-羟基末端，且该反应过程可逆。此外，T4 PNK还具有3'磷酸酶活性，可以将3'-磷酸基团从寡核苷酸的3'磷酸末端、脱氧3'-单磷酸核苷和脱氧3'-二磷酸核苷上水解掉。
【活性定义】
1活性单位(U)定义为在1×T4 PNK Buffer中，37°C、30 min内使1nmol的[γ-32P]ATP掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。
【应用范围】
1.对DNA或RNA5'末端进行磷酸化，以便进行连接反应。
2.DNA或RNA的末端标记，用作探针和进行DNA测序。
3.除去3'磷酸基团。
【质量控制】
蛋白纯度：经SDS-PAGE凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于95 % 。
非特异性内切酶活性：37°C下，在20 μl反应体系中将10 U T4 Polynucleotide Kinase与200 ng超螺旋质粒DNA共同温育4 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于20 % 的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。
DNase活性：37°C下，在20 μl反应体系中将10 U T4 Polynucleotide Kinase与15 ng双链DNA片段共同温育16 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，双链DNA片段无变化。
RNase活性：37°C下，在10 μl反应体系中将10 U T4 Polynucleotide Kinase与500 ng RNA共同温育1 h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，超过90 % 的RNA保持完整。
宿主DNA残留：采用中国药典2020版四部通则3407外源性DNA残留量测定法第三法定量PCR法，本品中大肠杆菌宿主细胞DNA残留量低于1拷贝/10U。
【使用方法】
1.DNA 5'末端磷酸化：
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试剂
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使用量
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底物
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1~300 pmol (5' 末端 )
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10× T4 PNK Buffer
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5 μl
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T4 Polynucleotide Kinase
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1 μl
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ATP (10 mM)
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5 μl
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ddH2O
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Up to 50 μl
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10×T4 PNK Buffer不含ATP，需自行准备。
①将上述体系充分混匀后，37°C温育30 min；
②反应完成后，75°C温育10 min使T4 Polynucleotide Kinase失活。
2.DNA 5'末端标记：
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试剂
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使用量
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底物
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1~50 pmol (5' 末端 )
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10× T4 PNK Buffer
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5 μl
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T4 Polynucleotide Kinase
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2 μl
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[γ-32P]ATP (10 mM)
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0.25 μl
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ddH2O
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Up to 50 μl
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10×T4 PNK Buffer不含放射性标记的ATP，需自行准备。
①将上述体系充分混匀后，37°C温育30 min；
②反应完成后，75°C温育10 min使T4 Polynucleotide Kinase失活
【注意事项】
1.金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50 mM的KCl和NaCl均可显著抑制T4 Polynucleotide Kinase的活性。
2.聚乙二醇(PEG)和亚精胺可改善磷酸化反应的速率和效率。
3.提高ATP的浓度可让缺口磷酸化。切刻位点不能有效地磷酸化。CTP、GTP、TTP、UTP、dATP及dTTP均可以替代ATP作为磷酸供体。
4.T4 Polynucleotide Kinase使用时宜置于冰上，使用完毕后立即放置于-20°C保存。
【储存条件及期限】
于-20℃保存
