【产品简介】
T7 EndonucleaseI(T7 EndoI,T7 EI)，中文名称T7核酸内切酶I，可识别并切割不完全配对DNA、十字型结构DNA、Holliday结构或DNA分叉点、异源双链DNA，切割位点位于错配位点5'端的第一、第二或第三个磷酸二酯键。此外T7EI也能以很慢的速度切割含有缺刻的双链DNA。值得注意的是，T7EI可以识别长度大于或等于2个碱基对( bp)的插入、缺失或突变导致的DNA错配，但不能识别1 bp的插入、缺失或突变。同时，T7 EndonucleaseI无法识别所有的DNA错配，对C错配的切割效果最佳。
本品为克隆重组T7 EndonucleaseI基因后在大肠杆菌中表达纯化获得的高纯度蛋白，不含其他内切酶或外切酶污染。
【活性定义】
1活性单位是指在50 μl体系中，37°C反应1h将1μg超螺旋十字形结构pUC(AT)的90 % 以上转换为线性结构所需的酶量。
【反应条件】
37°C反应15~30 min
【失活条件】
85°C加热15 min或加入1.5 μl的0.25 M EDTA终止酶切反应
【应用范围】
1.基因突变、SNP、TALEN或CRISPR/Cas9形成的突变体检测。
2.检测或切割异源双链DNA和切刻的DNA。
3.随机切割线性DNA进行鸟枪法克隆。
【质量控制】
蛋白纯度：经SDS-PAGE凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于95 % 。
非特异性内切酶活性：在20 μl反应体系中将10U T7 EndonucleaseI与200 ng的质粒DNA在37°C共同温育2h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于20 % 超螺旋质粒DNA转变成缺刻或线性状态。
DNase活性：在20 μl反应体系中将10U T7 EndonucleaseI与15 ng的双链DNA片段在37°C共同温育2h后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，双链DNA片段无变化。
【使用方法】
1.配制退火反应体系
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试剂
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实验组
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阴性对照 1
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阴性对照 2
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阳性对照
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PCR 产物 (Wild Type)
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200 ng
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200 ng
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-
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-
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PCR 产物 (Mutant)
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200 ng
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-
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200 ng
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Control Template (T7EI)
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-
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-
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-
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10× Cut Buffer G
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2 μl
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2 μl
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2 μl
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2 μl
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Nuclease-free water
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To 19 μl
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To 19 μl
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To 19 μl
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To 19 μl
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Control Template为突变型和野生型PCR产物1:1(各100 ng)的混合物，使用前需退火成含不配对的杂合链。退火后经T7 EI酶切产生620 bp和175 bp条带。
2.使用PCR仪退火
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温度
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时间
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95°C
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5 min
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95~85°C
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-2°C /s
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85~25°C
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-0.1°C /s
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4°C
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∞
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3.T7 Endonuclease I酶切
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试剂
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加入量
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“步骤1”的退火反应产物
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19 μl
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T7 Endonuclease I
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1 μl
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①37°C反应15~30 min；
②85°C加热15 min或加入1.5 μl的0.25 M EDTA终止酶切反应。
4.将酶切产物使用2 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测
【注意事项】
1.T7 Endonuclease I具有底物结构选择性，以不同的活性作用于不同的DNA底物。切割特定底物时必须控制酶量和反应时间以达到最佳酶切效果。
2.反应温度超过42°C时会使T7 Endonuclease I非特异性核酸酶活性增强，超过55°C会导致酶活下降。
3.Mn2+会显著增加T7 EndonucleaseI非特异性核酸酶活性，请使用不含Mn2+的PCR Buffer进行PCR扩增。
4.T7 Endonuclease I可兼容多种PCR Buffer，PCR产物可不经过纯化直接用于酶切检测，若酶切结果异常，可以将PCR产物纯化后再进行实验。
【储存条件及期限】
于-20℃保存
