【产品简介】

SpCas9-NLS是一种RNA介导的核酸内切酶，来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。该酶可在crRNA和tracrRNA(或两者连接形成的sgRNA)引导下，识别双链DNA靶标中PAM序列(5'- ngG)上游与sgRNA spacer序列互补的位置，并在PAM上游第3个碱基前端切割DNA双链。

SpCas9-NLS常用于基因编辑，为提高细胞内编辑效率，本品N端带有猴病毒40(SV40)T抗原核定位序列(NLS)。本品亦可用于体外靶标DNA的剪切和基因克隆等。

【失活条件】

85°C温浴5 min。

【质量控制】

蛋白纯度：使用SDS-PAGE凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于95 % 。

非特异性内切酶活性：将10pmol SpCas9-NLS与200 ng超螺旋质粒DNA在37°C温育4h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于10 % 的质粒DNA转变成缺刻或线性状态。

DNase活性：将10pmol SpCas9-NLS与15 ng双链DNA片段在37°C温育16h，使用琼脂糖凝胶电泳检测双链DNA底物无变化。

RNase活性：将10pmol SpCas9-NLS与500 ng总RNA在37°C温育1h，使用琼脂糖凝胶电泳检测超过90 % 的RNA仍保持完整。

【使用方法】

体外顺式切割实验

①在冰上配制如下反应体系：

 如果用凝胶电泳检测切割产物，建议Target DNA用量为100~500 ng，长度在300 bp~3kb之间。建议SpCas9-NLS:sgRNA:TargetDNA的摩尔比为10:10:1，尽量确保靶标DNA被完全切割。

b.sgRNA可参考以下序列设计：

5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG-3'（下划线表示TargetDNA特异性互补配对的spacer序列)。

②37°C反应30 min~1h后，85°C孵育5 min灭活；

③使用琼脂糖凝胶电泳检测产物。

【注意事项】

问题1 观察到目的DNA切割不完全。

回答1.2 SpCas9 Nuclease、gRNA、target DNA的比例不合适，推荐三者的摩尔比例至少为10:10:1也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分。

问题1.2 与gRNA的序列有关。根据target DNA选择更合适的gRNA序列，不同的gRNA的效果会差别比较大。

回答1.3 gRNA降解。通过凝胶电泳验证gRNA的完整性。

回答1.4 反应缓冲液不合适。请使用SpCas9 NLS自带的缓冲液10×Buffer C。

问题2 不同的gRNA之间的消化效率存在差异。

回答2.1 gRNA的序列设计。设计的gRNA需要进行序列与模板的验证。

回答2.2 gRNA的质量。利用琼脂糖凝胶电泳验证gRNA的完整性。