Fluo-4 是一种将 Fluo-3 结构中的 Cl 离子替换成F离子的钙荧光探针。由于将 Cl 离子替换成了电子吸引力更强的 F 离子，它的最大激发波长会向短波长方向偏离 10nm 左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo-4 的荧光强度比 Fluo-3 更强。

Fluo-4, AM ester 穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4 以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。