【产品概述】
抗GFP纳米抗体磁珠是由一种抗绿色荧光蛋白（GFP）重组纳米抗体与超顺磁性琼脂糖磁珠共价结合组成。纳米抗体微珠用于免疫共沉淀实验，IP复合物无论采用非变性洗脱还是变性洗脱均不会出现抗体的轻、重链污染问题，而且亲和力强，结合量高，特异性强，兼容性好，稳定性好。可用于从哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等各种生物的细胞提取物中免疫沉淀GFP标记的融合蛋白。
【微珠属性】
适用范围 IP、co-IP、ChIP、RIP、酶活测定、质谱分析
磁珠浓度 40% solids
适用抗体种属 绿色荧光蛋白及其衍生物
蛋白载量 20μg蛋白/μL磁珠
亲和常数（KD） 约1pM
耐受高温 55℃
磁珠储液 20% 乙醇
配基 羊驼纳米抗体（抗体分子量仅14 kDa)
每反应推荐用量 10μL
【试剂准备】
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缓冲液名称
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成分
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推荐使用圣尔产品
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Lysis buffer
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50 mM Tris-HCl pH7.5; 150 mM NaCl; 1% TritonX-100; 1 mM EDTA
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IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer
（圣尔#SB-IP011）
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RIPA buffer
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10 mM Tris-HCl pH7.5; 150 mM NaCl; 0.5 mM EDTA; 0.1% SDS; 1% Triton X-100; 1% Deoxycholate
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细胞/组织裂解液RIPA（强）
（圣尔#SB-BR040）
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Wash buffer
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50 mM Tris-HCl pH7.5;150 mM NaCl;1 mM EDTA
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IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer
（圣尔#SB-IP011）
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2×SDS loading buffer
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120 mM Tris-HCl pH6.8; 20% glycerol; 4% SDS； 0.04% Bromophenol blue;10% β-mercaptoehanol
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SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X无气味)（圣尔#SB-PR039）
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蛋白洗脱缓冲液（酸性）
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0.2 M glycine pH 2.5
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IP&co-IP酸性蛋白洗脱缓冲液
（圣尔#SB-IP012）
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中和缓冲液
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1 M Tris pH 10.4
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IP&co-IP中和缓冲液
（圣尔#SB-IP013）
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蛋白酶抑制剂
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1 M PMSF
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复合型蛋白酶抑制剂（100×)
（圣尔#SB-WB016）
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磁力架
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适配1.5/2 mL EP管
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16孔磁力架（1.5/2 mL EP tube）
（圣尔#SB-IP004）
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注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。
【使用说明】
以下方案描述了哺乳动物细胞裂解物的制备。对于其他类型的细胞，我们建议使用500µg细胞提取物，并从微珠平衡步骤开始实验。
1 细胞裂解
注意:使用预冷的缓冲液收获细胞并裂解细胞。强烈建议将蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中，
以防止目标蛋白及其结合物降解。对于一次免疫沉淀反应，我们推荐使用约106-107个细胞。
1.1 收集细胞，并加入预冷的完全裂解缓冲液。通过上下吹打将细胞团重悬于1 mL预冷的Lysis buffer中。
注：Lysis buffer使用前，需要额外添加完全蛋白酶抑制剂混合液。
1.2 冰上放置30分钟，然后每10分钟用移液管反复吹打5次。
1.3 低温离心4°C,17,000×g离心细胞裂解液10分钟。将澄清的裂解物（上清液）转移到预冷EP管中，如果需要，可保存50 μL 稀释的裂解物用于进一步分析（input对照）。
2 微珠平衡
2.1 通过200 μL移液枪吹打或上下颠倒轻弹EP管彻底悬浮微珠。不要漩涡微珠!
2.2 将10μL /反应的微珠悬浮液（4 μL干beads，可根据样品适当调整用量）转移到1.5 mL的离心管中。
2.3 加入1 mL预冷的裂解缓冲液，颠倒洗涤。
2.4 用磁力架分离微珠，直到上层溶液澄清。丢弃上清，重复1-2次。
3 蛋白结合
3.1 将裂解物上清加入到平衡的微珠中，每个反应4 μL干beads。
3.2 在4°C上下旋转1小时。
4 洗涤
4.1 用磁力架分离微珠，直到上层溶液澄清。
4.2 如果需要，可保存50μL 上清液用于进一步分析（穿流液/非结合组分）。
4.3 丢弃剩余的上层清液。
4.4 加入1 mL Wash buffer重悬微珠，上下颠倒5次洗涤。
4.5 用磁力架分离微珠，直到上层溶液澄清，丢弃剩余的上清液。
4.6 重复洗涤步骤（步骤4和5）至少两次。
可选：根据IP结果，为了提高洗涤效果，可测试各种盐浓度，如150 mM - 500 mM，和/或添加非离子洗涤剂。
5 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法
5.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）
彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。
5.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）
分离微珠，弃上清，向磁珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。
6 beads再生
酸性洗脱条件下，立即用中性缓冲液（如PBS）洗涤中和，收集后于4°C保存，磁珠可以再生使用，在常规使用条件下，
beads可在不明显影响磁珠性能的情况下再生使用至少10次。
6.1 使用5倍磁珠体积的蛋白洗脱缓冲液（酸性），颠倒洗涤磁珠5分钟。重复3次。
6.2 使用5倍体积的20%乙醇洗涤磁珠，颠倒洗涤磁珠5分钟。重复5次。
6.3 吸净液体后，加入20%乙醇重悬磁珠即可，并于4度保存。
6.4 （选做）再生后的磁珠可取少量磁珠使用SDS loading buffer直接煮样后，用SDS-page考马斯亮蓝染色检查再生情况,同时可与新磁珠比较检查结合效率。
【注意事项】
1 严禁冻结。
2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。
3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。
4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。
5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl2、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。
6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。
7 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。
8 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100
【常见问题】
问题1 目标条带较弱/没有
可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。
问题2 背景太高
可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。
问题3 杂带较多
可能原因：磁珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。
本产品仅供科研使用。
【储存条件及期限】
存放于4°C，微珠禁止冻结，有效期12个月；冰袋运输
