【产品组成】

中文名称	英文名称	SB-PR066-12T	SB-PR066-4T		保存温度
无RNA酶PBS	RNA free PBS	100 mL	35 mL		4°C
RIP裂解液	RIP lysis buffer	6 mL	2 mL		4°C
氧钒核糖核苷复合物	Ribonucleoside Vanadyl Complexes, RVC	120 μL	40 μL		-20°C
蛋白酶抑制剂	Protease inhibitor cocktail	330 μL	110 μL		-20°C
RNA酶抑制剂	Recombinant Rnase inhibitor	300 μL	100 μL		-20°C
磁珠	Protein A/G magnetic	800 μL	300 μL		4°C
RIP缓冲液	RIP buffer	40 mL	20 mL		4°C
洗涤缓冲液	Wash buffer	50 mL	20 mL		4°C
DNA酶I	DNase I	40 μL	15 μL		-20°C
DNA酶1反应液	DNase I reaction buffer	360 μL	120 μL		-20°C
30mM EDTA	Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA (30mM)	300 μL	100 μL		-20°C
10% SDS	Sodium dodecyl sμLfate, SDS	700 μL	250 μL		4°C
蛋白酶K	Proteinase K	500 μL	200 μL		-20°C
Trizol	Trizol reagent	自备
氯仿	Chloroform	自备
3M 醋酸钠，pH5.2	Sodium acetate, 3M，pH5.2	2 mL	1 mL		4°C
糖原	Glycogen	180 μL	60 μL		-20°C
异丙醇	Isopropyl alcohol	自备
75%乙醇	75% ethanol water	自备
无水乙醇	Ethanol	自备
DEPC 水	DEPC treated water	1 mL	500 μL		4°C
WB相关试剂	WB-related reagents	自备
RT-qPCR相关试剂	RT-qPCR related reagents	自备

【产品简介】

RNA结合蛋白免疫共沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation，RIP）是基于抗原抗体特异性结合的原理，在抗体结合靶蛋白的同时把与靶蛋白结合的RNA富集纯化的一种生化实验技术。RIP富集的RNA产物结合下游高通量测序（RIP-Seq）、芯片分析（RIP-chip）技术可以高通量筛靶蛋白结合RNA，也可以通过RT-qPCR验证靶蛋白与RNA的相互作用。

【产品应用】

RIP技术是由蛋白起始，探索感兴趣蛋白与RNA的结合及调控，以及蛋白受RNA分子调控有效技术手段，至少有以下几个应用场景：

1 筛选鉴定经典RNA结合蛋白（比如RBM家族）结合的RNA，研究其对RNA转录、剪接、修饰、转运、翻译等调控过程。

2 研究明确的蛋白RNA复合体（比如核糖核蛋白体）对RNA的结合，研究其在生理、病理状态其复合体功能变化。

3 探索RNA类似物结合蛋白（比如转录因子）对RNA的结合，研究其活性受RNA的调控，尤其是非编码RNA的调控。

4 探索其他感兴趣蛋白的活性、定位、翻译后修饰、稳定性、相互作用分子在各种正常生命活动调控过程中受RNA的调控。

【使用方法】

1 实验前准备

1.1 样本类型及样本量 根据实验目的，选择合适的样本类型及样本量。一般一次RIP实验至少需要做2个反应，即抗体组和同种属IgG对照组。更严谨的做法可以平行做阳性抗体（比如SNRNP70）及对应IgG对照用于监控RIP实验过程，一共4个反应。常见哺乳动物细胞系、原代细胞、PBMC、组织推荐样本样品用量如比表2：

样品类型	样品量（2个反应）	裂解液用量	备注
悬浮细胞	4×107	400 μL	参考K562细胞，约10 cm培养皿4皿细胞
贴壁细胞	4×107	400 μL	参考Hela细胞，约10 cm培养皿4皿细胞
原代细胞	4-6×107	400 μL	参考PBMC
哺乳动物组织	50 mg	500 μL	参考10%左右蛋白提取效率的组织，比如肝脏
植物/真菌组织	50-200 mg	500-1000 μL	以2%-10%蛋白提取效率为例
单细胞生物	107-109	500 μL	以有效提取到4-5 mg蛋白为参考

1.2 抗体 抗体是决定实验成败的关键材料之一，通常选取厂家或公开发表数据已验证可用于做IP或Co-IP的抗体，抗体的抗原识别表位尽量避开明确的RNA结合结构域，如有抗体亲和力数据则尽量选择亲和力高的抗体。通常在正式RIP实验前，参考RIP实验体系，做IP并WB验证抗体有效性，具体参考IP效率验证环节。

1.3 实验场所及防护 RNA实验对环境RNA污染尤为敏感，实验前需要确保实验台清洁，并用RNA酶清除试剂或75%乙醇擦拭干净。如有条件可以全程在生物安全柜或超净台内完成。操作过程佩戴口罩并勤换一次性手套。

1.4 实验试剂耗材 实验前确保所有试剂盒包含试剂耗材及自备试剂耗材足够完成实验。通用试剂耗材尽量不与其他实验混用。

2 样品准备

此步骤对细胞或组织样本进行初步处理以获得均质的细胞裂解产物供后续RIP及质控实验使用。细胞、组织类型众多，此处只介绍最常见的哺乳动物来源的悬浮细胞、贴壁细胞、原代细胞，组织的裂解流程。非经典样本类型可以咨询技术支持。样本用量以2个反应为例。样品准备及后续实验除加热步骤外，均在冰上操作。

2.1 裂解液准备

样品处理前，根据样品量，配置裂解液，每次实验（以经典细胞2个反应为例）需要400 μL RIP Lysis Buffer，加1 μL VRC（1：400），8 μL 蛋白酶抑制剂（1：50），8 μL RNA酶抑制剂（1：50），冰浴备用，1小时内使用。

2.2a 悬浮细胞收集

1. 收取4×10⁷细胞，200×g，室温，离心5分钟，弃培养基上清。

2. 用5 mL RNA free PBS重悬，200×g，室温，离心5分钟，弃上清。

3. 用1 mL RNA free PBS重悬细胞并转移至1.5 mL EP管，1000×g，4°C，离心3分钟，弃上清。

4. 细胞沉淀涡旋震荡松散，小心加入400 μL RIP Lysis Buffer，轻轻吹打混匀，置于-80°C至少8小时，备用。

 PBMC细胞（或外周血裂红之后的白细胞）可参考悬浮细胞处理。

2.2b 贴壁细胞收集

1. 细胞培养至所需细胞量后，弃培养基上清。

2. 每皿细胞沿壁轻轻加入5mL RNA free PBS，轻轻旋转摇匀5圈，弃上清。

3. 重新加5 mL RNA free PBS，用细胞刮将单细胞层轻轻刮下，全部转移至离心管。

4. 200×g，室温，离心5分钟，弃培养基上清。

5. 1mL RNA free PBS重悬细胞，转移至1.5 mL EP管，1000×g，4°C，离心3分钟，弃上清。

6. 细胞沉淀涡旋震荡松散，小心加入400 μL RIP Lysis Buffer，轻轻吹打混匀，置于-80°C至少8小时，备用。

 贴壁原代细胞可参考贴壁细胞系处理。

2.2c 哺乳动物组织准备

1. 准备好干净的研钵、研杵、干冰、液氮、无尘吸水纸，药勺。

2. 取约大于50 mg的新鲜组织，准确称量，记录湿重，放入10 cm 培养皿，加入5 mL RNA free PBS，清洗血渍。

3. 研杵放入研钵，倒入适当液氮预冷。

4. 镊子夹住组织悬于无尘吸水纸，吸走表面残留PBS后轻轻放入倒有液氮的研钵。

5. 迅速将组织磨成粉末状后，将研钵放置于干冰表面。如果是冷冻保存的组织，则直接研磨。

6. 1.5 mL EP管预冷，去皮，称取50 mg左右粉末转移至1.5 mL EP管。

7. 小心加入500 μL RIP Lysis Buffer，轻轻吹打混匀，置于-80°C至少8小时，备用。

 植物或真菌组织，可参考哺乳动物组织处理。新鲜组织在研磨前需要清洗干净并吸干肉眼可见水滴，剪碎后液氮研磨。组织量每次实验取50-200 mg，以有效提取4-5 mg蛋白为参考用量。

2.2d 单细胞生物准备

1. 以大肠杆菌为例，收取50mL对数生长菌液（OD值0.5-1.0），16000×g，离心2分钟，弃培养基上清。

2. 1mL RNA free PBS重悬，转移至1.5 mL EP管，16000×g，4°C，离心2分钟，保留沉淀量100-150 μL。

3. 细胞沉淀涡旋震荡松散，小心加入500 μL RIP Lysis Buffer，冰浴超声破碎。推荐超声条件：功率300W，超声工作时间10s，间歇10s，循环次数20-50次。镜检判断90%以上细菌破碎为准。

4. 超声产物置于-80°C至少8小时，备用。

 其他单细胞生物可参考细菌裂解，取样量视细胞大小和蛋白提取效率而定，以有效提取4-5 mg蛋白为参考用量。超声条件根据有无细胞壁及细胞壁坚固程度适当调整，镜检确认。

2.3 裂解产物分离 通常样本经过温和裂解液化学裂解后，需要-80°C冻存过夜或8小时以上再解冻完成彻底裂解。过夜后取出，冰浴解冻。4°C颠转孵育15分钟。16000×g，4°C，离心10分钟，小心吸取上清裂解产物约450μL转移至1.5 mL EP管。

3 免疫共沉淀

3.1 留取Input 准备两个1.5 mLEP管，每管取10 μL裂解产物，分别做为RNA Input和蛋白Input样本，-20°C暂存过夜。

3.2 配置IP buffer 吸取1.6 mL IP Buffer，加入16 μL 蛋白酶抑制剂（1:100），16 μL RNA酶抑制剂（1:100），冰浴备用。

3.3 准备beads 每个反应取50 μL Protein A/G beads，加500 μL Wash Buffer重悬，放置1-2分钟，置于磁力架静置1-2分钟待beads全部贴壁后，吸走全部上清。Wash Buffer重复清洗一次。

3.4 配置反应体系 每管加800 μL 3.1步中配置的含有抑制剂的IP Buffer，2.3步分离的200μL裂解产物，其中一管加10 μg抗体作为实验组，另一管加同种属的IgG作为对照，轻轻颠倒混匀。

3.5 免疫共沉淀反应 封口膜包扎好上述反应管，4°C颠转孵育过夜。

3.6 配置IP Wash Buffer 第二天，吸取4mL IP Buffer，加入10 μL 蛋白酶抑制剂（1:400），16 μL VRC（1:400），冰浴备用。

3.7 留取反应上清 准备4个1.5 mL EP管，反应过夜后取出反应EP管，置于磁力架2-3分钟，待beads全部贴壁后抗体和IgG组各取100μL上清作为蛋白上清管，100 μL上清作为RNA上清管，-20°C暂存。

3.8 洗涤1 反应管加入上述IP Wash Buffer 1mL，轻轻颠倒混匀，4°C颠转孵育5-10分钟，取出置于磁力架1-2分钟，待beads全部贴壁后弃上清。重复此步骤1-2次，共2-3次。

3.9 洗涤2 反应管加入wash buffer 1mL，颠倒混匀，4°C颠转孵育5-10分钟，取出置于磁力架1-2分钟，待beads全部贴壁后弃上清。重复此步骤1-2次，共2-3次。

3.10 取IP富集蛋白 加入wash buffer 1mL，轻轻吹打混匀后实验组和对照组各取100μL至新的EP管，置于磁力架1-2分钟，待beads全部贴壁后弃上清，作为IP富集蛋白，马上洗脱（见质控章节）或-20°C暂存。

3.11 回收RIP产物 反应管置于磁力架1-2分钟，待beads全部贴壁后吸尽上清，保留beads往下操作。

4 RNA抽提

4.1 DNA消化 取出RNA Input管和上清管，加入DNase I反应体系（表3），吹打混匀，37°C，800rpm，震荡孵育30分钟。

样品	原体积	wash Buffer	Reaction Buffer	DNase I	Rnase inhibitor
Input	10 μL	90 μL	11 μL	1 μL	1.0 μL
Beads	0 μL	100 μL	11 μL	1 μL	1.0 μL
上清	100 μL	0 μL	11 μL	1 μL	1.0 μL

4.2 蛋白消化 向上述各管加，8 μL 30mM的EDTA，15μL 10% SDS，混匀后加15μL proteinase K，55°C，800rpm，震荡孵育15分钟。

4.3 Trizol提取 蛋白消化结束后，EP管瞬时离心，将beads组EP管放置于磁力架，静置1-2分钟待beads全部贴壁后吸取所有上清至新的EP管。Input，Beads和上清组每管加1 mL Trizol，吹打混匀，加230 μL氯仿，震荡混匀，冰浴静置3-5分钟至溶液分层。

4.4 离心分离 16000×g，4°C，离心10分钟，小心吸取上清约650 μL。

4.5 RNA沉淀 各管加65 μL pH5.4的NaAc，5 μL糖原，震荡混匀，加720 μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20°C沉淀1小时或过夜。

4.6 离心 沉淀反应结束后，16000×g，4°C，离心30分钟，弃上清。

4.7 洗涤1 加500 μL 75%无水乙醇，轻轻颠倒至沉淀悬浮，16000×g，4°C，离心10分钟，弃上清。

4.8 洗涤2 加500 μL 无水乙醇，轻轻颠倒至沉淀悬浮，16000×g，4°C，离心10分钟，吸尽上清，自然干燥5-10分钟至无明显液滴。

4.9 RNA溶解 Beads组20-30 μL DEPC水溶解，Input和上清组50-100 μL DEPC水溶解。

4.10 RNA定量 RNA可以用Nanodrop、Quibit或Agilent 2100检测浓度及条带，通常抗体和IgG组Nanodrop定量可测的总量为200-1000 ng，测量结束后可以马上进行后续实验或-80°C保存备用。

【质控步骤】

1 IP效率验证

1. IP蛋白洗脱 RIP反应洗涤结束后留取的beads，每管加50 μL wash buffer，5 μL 10% SDS，90°C，震荡洗脱10分钟后，将EP管放置于磁力架，静置1-2分钟待beads全部贴壁后吸取所有上清55 μL至新的EP管。

2. WB样本制备 取出蛋白Input管1管、IP、IgG上清管2管，共3管蛋白样品。Input管加90 μL wash buffer及10 μL 10% SDS稀释至100 μL，IP及IgG上清加10 μL10% SDS。Input和上清总体积均为100 μL，根据各样本实际体积加电泳loading Buffer，95-100°C煮10分钟。

3. WB检测 将上述5个样本电泳，检测靶蛋白强度。

4. 质控分析 IP条带显著强于IgG（或IgG无条带），则说明抗体可以显著富集靶蛋白，两者差异越大，说明抗体亲和力强。IP显著强于Input说明抗体富集有很强的亲和力并且高效的富集了靶蛋白。IP上清和IgG上清相比减少的量即为IP过程中有效富集的量，IP上清减弱越多，说明效率越高。

图 WB检测：U1剪接体SNRNP70蛋白。使用Millipore, Anti-SNRNP70抗体（#CS203216）

2 RNA结合验证

在正式RIP实验或者在实验人员首次操作RIP实验时建议平行做质控实验，通过RT-qPCR验证并优化实验体系。在验证已知蛋白和RNA相互作用时，也可以在RIP实验之后用富集产物做RT-qPCR进行验证。下文以RIP质控抗体SNRNP70为例简述RT-PCR实验设计及质控分析。

2.1 逆转录 从Input、IP，IgG及对应上清5组中取等重量的RNA，逆转录为cDNA

2.2 qPCR检测 qPCR检测U1 snRNA在上述5个样本的中相对表达，每个样本3个重复。

2.3 数据分析 以IgG组为对照，采用2^-△△Ct法分析各组相对表达量。

2.4 质控分析 IP相比IgG有显著升高，意味着靶蛋白结合次RNA。IP相比Input有显著升高，意味着靶蛋白对次RNA富集效率很高。IP上清相比IgG上清有显著下降，说明靶蛋白与RNA结合。

 

图 qPCR检测：与U1剪接体SNRNP70蛋白共沉淀的U1snRNA。使用引物F：GGGAGATACCATGATCACGAAGGT，R：CCACAAATTATGCAGTCGAGTTTCCC。

【储存条件及期限】 各组分在不同温度保存