如何选择PVDF膜及NC膜？
Western Blot（蛋白质免疫印迹）是分子生物学和生物化学研究中不可或缺的技术，用于检测和定量特定蛋白质。在WB实验中，转印膜的选择对实验结果有着至关重要的影响。目前最常用的两种转印膜是聚偏二氟乙烯膜（PVDF）和硝酸纤维素膜（NC）。圣尔PVDF膜及NC膜在以下特性表现优异（价格优美）：
- 蛋白结合能力
- 背景信号
- 化学兼容性
- 机械强度
- 操作便捷性
本文对PVDF膜及NC膜从基本特性，WB实验流程，相关实验试剂及耗材做详细介绍。
PVDF膜与NC膜的比较
基本特性对比
| 特性 | PVDF膜 | NC膜 |
|---|---|---|
| 化学组成 | 聚偏二氟乙烯 | 硝酸纤维素 |
| 蛋白结合机制 | 疏水作用和静电作用 | 疏水作用 |
| 蛋白结合能力 | 100-200μg/cm² | 80-100μg/cm² |
| 机械强度 | 高，柔韧不易破损 | 低，脆性易破损 |
| 化学稳定性 | 耐酸碱和有机溶剂 | 对酸碱和有机溶剂敏感 |
| 温度耐受范围 | -10℃至150℃ | -10℃至40℃ |
| 保质期 | 3-5年 | 5年以上 |
| 成本 | 较高 | 较低 |
技术参数对比
| 参数 | PVDF膜 | NC膜 |
|---|---|---|
| 预处理要求 | 需甲醇活化(3-30秒) | 仅需蒸馏水润湿 |
| 孔径选择 | 0.2μm(小蛋白)<20kD 0.45μm(大蛋白)>20kD |
0.1μm(小蛋白)<7kD 0.22μm(小蛋白)<20kD 0.45μm(大蛋白)>20kD |
| 背景信号 | 较高，需严格封闭 | 较低，信噪比优 |
| 重复使用性 | 可剥离抗体重复使用 | 一般不重复使用 |
| 适用检测方法 | 化学发光(ECL)、DAB显色 | 化学发光(ECL)、荧光检测 |
| 小分子蛋白保留 | 结合牢固不易丢失 | 洗涤时易丢失 |
PVDF膜与NC膜各自的优势
PVDF膜的主要优势
- 更高的蛋白结合能力：PVDF膜的蛋白结合量(100-200μg/cm²)比NC膜(80-100μg/cm²)高出约6倍，特别适合低丰度蛋白检测
- 优异的机械强度：PVDF膜柔韧耐用，可承受多次洗涤和抗体剥离操作，适合需要多次检测同一样本的实验
- 更好的化学稳定性：耐酸碱和有机溶剂，适用于苛刻的染色条件和多种检测方法
- 小分子蛋白保留能力强：对小于20kD的小分子蛋白结合更牢固，不易在洗涤过程中丢失
- 温度耐受范围广：可在-10℃至150℃范围内保持稳定，适合高温处理
NC膜的主要优势
- 更低的背景信号：NC膜本身产生的背景非常低，可获得更清晰的结果和优异的信噪比
- 操作简便：无需甲醇活化，仅需蒸馏水润湿即可使用，减少了有毒试剂接触
- 更适合大分子蛋白：对大分子蛋白和蛋白质聚合物的吸附效果更好
- 成本较低：NC膜价格通常比PVDF膜低，适合大规模实验
- 保质期更长：NC膜在适当条件下可保存5年以上
- 适合荧光检测：PVDF膜在荧光检测中背景较高，而NC膜更适合荧光WB实验
应用场景选择指南
推荐使用PVDF膜的情况
- 检测小分子量蛋白(<20kD)
- 低丰度蛋白检测
- 需要多次抗体剥离和重新检测的实验
- 使用DAB显色的实验
- 需要长期保存的实验结果
- 涉及苛刻染色条件的实验
推荐使用NC膜的情况
- 检测大分子量蛋白(>20kD)和蛋白质聚合物
- 荧光Western Blot实验
- 需要最低背景信号的实验
- 初学者或需要简化操作流程的实验
- 大规模筛选实验(考虑成本因素)
- 亲水性蛋白的检测
专业建议：对于分子量在20kD左右的蛋白，两种膜均可使用，但需根据具体实验条件选择。PVDF膜通常需要更严格的封闭条件(如5%脱脂奶粉或3%BSA封闭1小时以上)来降低背景，而NC膜对封闭条件要求相对较低。
Western Blot实验标准流程
实验前准备
- 根据目标蛋白分子量选择适当孔径的膜：0.2μm用于小蛋白(<20kD)，0.45μm用于大蛋白(>20kD)
- PVDF膜使用前需在甲醇中浸泡3-30秒活化，然后转移至转膜缓冲液平衡；NC膜仅需在蒸馏水中润湿后置于转膜缓冲液
- 准备适当浓度的SDS-PAGE凝胶：6%-15%分离胶，根据蛋白大小选择最佳分离范围
详细实验步骤
蛋白样品制备
使用裂解液(RIPA等)提取细胞或组织蛋白，加入蛋白酶抑制剂(PMSF)和磷酸酶抑制剂(根据需求)。离心去除不溶物，取上清进行蛋白定量(BCA或Bradford法)。用Loading Buffer稀释样品，煮沸5分钟使蛋白变性。
SDS-PAGE电泳
安装电泳装置，加入电泳缓冲液。按预定顺序上样，包括预染蛋白Marker。初始电压80V使样品通过浓缩胶，然后调至120V进行分离胶电泳，直至染料前沿到达凝胶底部。
转膜
准备转膜"三明治"结构：从负极到正极为海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵。确保无气泡。根据膜面积设置转膜条件：湿转法一般100V 1小时或30V过夜；半干转法根据膜面积设置电流和时间。
封闭
转膜完成后，用TBST洗涤膜5分钟。使用5%脱脂奶粉或3%BSA的TBST溶液室温封闭1小时，以阻断非特异性结合位点。
一抗孵育
用封闭液或TBST按推荐比例稀释一抗。将膜与一抗溶液4℃孵育过夜或室温孵育2小时。TBST洗涤3次，每次10分钟。
二抗孵育
用TBST按推荐比例稀释HRP标记的二抗。室温孵育1小时。TBST洗涤3次，每次10分钟。
显色与成像
按1:1比例混合ECL发光液的A液和B液，均匀覆盖膜表面。孵育1分钟后去除多余液体，用化学发光成像系统检测信号。
WB实验所需试剂与耗材清单（点击以下编号可直接进入详情页订购，页面下方关联部分产品，可直接选购）
主要试剂
- 细胞裂解液(RIPA等)SB-C008
- 蛋白酶抑制剂SB-WB016
- 磷酸酶抑制剂(根据需求)SB-WB017
- 蛋白定量试剂(BCA或Bradford法)SB-WB013
- SDS-PAGE Loading Buffer(还原型，5×)SB-PR037
- 丙烯酰胺/Bis溶液(30%)SB-ST003
- Tris-HCl缓冲液(pH 8.8和6.8)SB-WB112
- 预制胶SB-TG1000815
- 蛋白MarkerSB-WB009
- 电泳缓冲液(Tris-Glycine-SDS)SB-CPR006M
- 转膜缓冲液(Tris-Glycine或CAPS)SB-CPR037
- 封闭剂(脱脂奶粉或BSA)SB-PR079
- TBST缓冲液(TBS+0.1% Tween-20)SB-CPR009
- 一抗(针对目标蛋白)可自行在官网搜索
- HRP标记的二抗可自行在官网搜索
- ECL化学发光底物SB-WB004
- 丽春红染液(可选，用于转膜验证)SB-WB206
主要耗材与设备
常见问题解答(FAQ)
对于PVDF膜：大于20kD的蛋白选择0.45μm孔径，小于20kD的蛋白选择0.2μm孔径。对于NC膜：大于20kD的蛋白可用0.45μm，小于20kD的蛋白用0.22μm，小于7kD的极小蛋白可用0.1μm孔径。
PVDF膜是疏水性材料，甲醇浸泡可以去除膜表面的疏水层，使膜从白色不透明变为半透明，同时活化膜上的正电基团，增强与带负电荷蛋白的结合能力。活化时间通常为3-30秒，过长时间可能导致膜过度收缩。
不可以。NC膜接触甲醇会导致膜皱缩、卷曲，严重影响蛋白结合能力。NC膜只需用蒸馏水简单润湿后置于转膜缓冲液即可使用。
PVDF膜具有更高的蛋白结合能力，包括非特异性蛋白，因此需要更严格的封闭条件(如延长封闭时间或增加封闭剂浓度)来降低背景。NC膜本身非特异性结合较少，背景通常较低。
蛋白"转过头"指蛋白完全穿过膜未被截留。
解决措施包括：1)检查膜孔径是否合适；2)缩短转膜时间或降低电压；3)对于小蛋白可尝试0.1-0.2μm孔径的膜；4)使用PVDF膜因其截留率通常高于NC膜。
脱脂奶粉(5%)适用于大多数情况且成本低，但可能含有目标蛋白或磷酸化蛋白导致背景；BSA(3-5%)更纯净，适合磷酸化蛋白检测，但成本较高。对于PVDF膜，有时需要BSA来获得更好的封闭效果。
PVDF膜可以通过抗体剥离液(如pH2.0甘氨酸或β-巯基乙醇)去除结合的抗体，然后重新封闭和孵育新抗体。NC膜通常不建议重复使用，因其机械强度较差且在剥离过程中易损坏。
PVDF膜在荧光检测中会产生较高的自发荧光背景，而NC膜的自发荧光很低，能提供更好的信噪比。此外，荧光染料标记的二抗通常较大，与NC膜的兼容性更好。
显影后的膜可用保鲜膜包裹，4℃短期保存或-20℃长期保存。PVDF膜保存性能优于NC膜。对于需要重复检测的膜，可在TBST中4℃短期保存，但不宜超过1周。
可通过以下方法验证：1)使用预染蛋白Marker观察条带是否转移到膜上；2)用丽春红染色膜检测蛋白分布；3)检测内参蛋白(如GAPDH、β-actin)信号。转膜不充分通常表现为凝胶中残留蛋白(考马斯亮蓝染色可见)而膜上信号弱。
部分结果展示
PVDF膜测评
- 在相同实验条件下，将等浓度梯度的样本Marker进行电泳后同步转印至PVDF膜。
- 实验结果表明，圣尔share-bio（SB-WB308） PVDF膜的性能与进口膜相当，且甲醇激活只需3S，操作更方便。
NC膜测评
- 在相同实验条件下，将等浓度梯度的样本Marker进行电泳后同步转印至NC膜。
- 实验结果表明，圣尔share-bio三种孔径NC膜的性能与进口膜相当。此外，该NC膜在孵育后仍保持适中的软硬度，显著提升了实验操作的便利性。
