TMB是辣根过氧化物酶（HRP）的最灵敏的显色底物之一，无致癌性。在HRP的催化下，TMB被过氧化氢（H₂O₂）氧化生成蓝色产物。TMB显色液主要应用于基于HRP的免疫分析，包括免疫印迹WB、免疫组化、ELISA、免疫斑点杂交检测分析。

底物溶液吸收峰在370 nm和652 nm。在加入硫酸或者磷酸终止(终止液需自备)上述反应后，产物转变为黄色，最大吸收峰为450 nm。

【溶解性】

略显浅黄色的澄明液体，底物溶液OD₆₅₀<0.08。

【操作步骤】

1 用适当的干净容器，倒出适量的单组分TMB显色液，待达到室温后即可使用。

2 加液：加完HRP结合物并温育一定时间后，洗板3-5次，如，每孔加TMB显色液100ul。根据实验，在室温(15-25°C)温育10-30分钟。

3 终止：加50ul的2N盐酸或硫酸溶液终止反应，孔中反应液由蓝色变为黄色。

4 读数：终止反应后20分钟内在450nm处读数。

5 注意：如果出现高的反应背景或沉淀，表明TMB底物反应过于强烈。为了避免产生沉淀，可在终止后马上读数；或者进一步稀释一抗和/或HRP结合物。