【产品概述】
抗HA标签磁珠是在纳米级磁颗粒表面共价结合了大量的小鼠源抗HA标签的单克隆抗体，与普通琼脂糖胶珠相比结合能力相同，背景更低。本琼脂糖磁珠可磁性分离，每次IP流程可省时近40%。适用于哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等各种生物的细胞提取物。
【微珠属性】
适用范围 IP、co-IP、蛋白纯化
磁珠直径 2 μm
适用抗体种属 HA标签的融合蛋白
蛋白载量 大于 0.6 mg protein/mL磁珠
耐受高温 不耐高温
配基 鼠源IgG3a
【试剂准备】
|
缓冲液名称
|
成分
|
推荐使用圣尔产品
|
|
Lysis buffer
|
50 mM Tris-HCl pH7.5; 150 mM NaCl; 1% TritonX-100; 1 mM EDTA
|
IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer
（圣尔#SB-IP011）
|
|
RIPA buffer
|
10 mM Tris-HCl pH7.5; 150 mM NaCl; 0.5 mM EDTA; 0.1% SDS; 1% Triton X-100; 1% Deoxycholate
|
细胞/组织裂解液RIPA（强）
（圣尔#SB-BR040）
|
|
Wash buffer
|
50 mM Tris-HCl pH7.5;150 mM NaCl;1 mM EDTA
|
IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer
（圣尔#SB-IP011）
|
|
2×SDS loading buffer
|
120 mM Tris-HCl pH6.8; 20% glycerol; 4% SDS； 0.04% Bromophenol blue;10% β-mercaptoehanol
|
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X无气味)（圣尔#SB-PR039）
|
|
蛋白洗脱缓冲液（酸性）
|
0.2 M glycine pH 2.5
|
IP&co-IP酸性蛋白洗脱缓冲液
（圣尔#SB-IP012）
|
|
中和缓冲液
|
1 M Tris pH 10.4
|
IP&co-IP中和缓冲液
（圣尔#SB-IP013）
|
|
蛋白酶抑制剂
|
1 M PMSF
|
复合型蛋白酶抑制剂（100×)
（圣尔#SB-WB016）
|
|
磁力架
|
适配1.5/2 mL EP管
|
16孔磁力架（1.5/2 mL EP tube）
（圣尔#SB-IP004）
|
注意：使用前在Lysis buffer、Wash buffer或IP&co-IP裂解、结合、清洗buffer（圣尔#SB-IP011）中添加适量的蛋白酶抑制剂。
【使用说明】
1. 抗原样品制备（样本类型包括血清、悬浮细胞、贴壁细胞、大肠杆菌）：
血清样本： 若目标蛋白丰度较高，建议用Lysis buffer稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL，置于冰上备用。
悬浮细胞样本： 离心收集细胞(4°C，500×g，10 min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50 μL的比例用1×PBS洗涤2次；按每毫克细胞5-10 μL的比例加入Lysis buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10min；离心收集上清液(4°C, 1,4000×g, 10 min)，置于冰上备用(或置于-20°C长期保存)。
贴壁细胞样本 移去培养基，按每1.0×105个细胞150 μL 的比例用1×PBS洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每1×105个细胞20-30 μL的比例加入Lysis buffer，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4°C，1,4000×g，10 min)， 置于冰上备用(或置于-80°C长期保存)。
大肠杆菌样本： 离心收集大肠杆菌(4°C，1,2000×g,2 min)，弃上清后称重，按每克（湿重）菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤2次；按每克（湿重）菌体5-10 mL的比例加入Lysis buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF），重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4°C，1,7000×g,10 min)。
2 磁珠平衡
手动混匀微珠悬液，吸取取10 μL到500 μL Lysis buffer或PBST，洗涤3次，分离磁珠，弃上清。
3 免疫沉淀
在平衡好的微珠中加入500 μL细胞裂解液（按每500 μL裂解液加10 μL磁珠悬液比例混合孵育），室温缓慢孵育2 小时或者4°C条件下过夜，分离磁珠，弃上清。
4 洗涤
400 µL Wash buffer或PBST缓冲液洗涤4次，每次5 min，分离磁珠，弃上清。
5 洗脱蛋白：根据后续检测方案选择不同的洗脱方法
5.1 变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）
彻底吸去剩余的上清液,加入30-50 μL的2×SDS-PAGE loading buffer重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心让样品沉淀。将样品加热95°C，10分钟。分离微珠，将上清液转移到新管。上清液为样品，用于后续SDS-PAGE、WB分析。
5.2 非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）
分离微珠，弃上清，向磁珠中加入50 μL蛋白洗脱缓冲液（酸性），在室温或低温不停吹打或震荡30-60秒。室温洗脱比4°C效率更高，建议酸性洗脱缓冲液在室温下预温。分离微珠，收集上清至新管，并立即加入5 μL的中和缓冲液，使洗脱产物pH调节至中性，样品用于后续分析。
5.3 多肽竞争洗脱法：（此方法为非变性洗脱法，洗脱后的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析）
取适量HA多肽溶解于1×TBS中，配置成200 μg/mL HA洗脱液。向磁珠中加入100 μL多肽洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4°C孵育4-6小时。孵育完成之后，分离微珠，将上清转移到新的离心管，上清即为洗脱的HA标签蛋白。
【注意事项】
1 严禁冻结。
2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。
3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。
4 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，强烈建议在蛋白样品、Lysis buffer、Wash buffer中都添加适量的蛋白酶抑制剂。细胞裂解物可置于-80°C下长期保存。
5 裂解核蛋白，可在PIPA（强）裂解液中加入1mg/mL DNaseI、2.5 mM MgCl2、蛋白酶抑制剂和1 mM PMSF。
6 在结合反应过程中，微珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象。
7 当目标蛋白分子量大小为50 kD或者25 kD时，建议更换轻链抗体/重链抗体，或使用纳米抗体磁珠，以尽量减少变性重链或轻链对SDS-PAGE和WB结果产生的干扰。
8 质控取样点1：样本充分裂解后，取数十微升样本，记作Input，即为反应前样本；质控取样点2：样本免疫沉淀孵育结束后，取上清样本10-50 μL，记作supernatant，即为上清样本。
9 缓冲液最大兼容性：1mM DTT（二硫苏糖醇）；3 M 脈盐•HCI；8 M 尿素；2 M NaCl；2% NP-40；1% SDS；1% Triton X-100
【常见问题】
问题1 目标条带较弱/没有
可能原因：样品降解，需添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融；抗体浓度太低，需增加抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；抗体亲合力太低，选用适合于IP/co-IP的相应抗体。
问题2 背景太高
可能原因：在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前增加微珠预洗、免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂，如在第二次洗涤的步骤中增加NaCl浓度到500 mM）；改用高严谨度裂解液；使用洁净的仪器或液体；不要接触WB的膜转移面。
问题3 杂带较多
可能原因：磁珠的非特异性结合，或者样本上样量过高、或者抗体浓度过高。建议实验前对微珠增加漂洗，实验过程中增加洗涤次数，使用合适的样品和抗体浓度。
本产品仅供科研使用。
【储存条件及期限】
存放于4°C，微珠禁止冻结，有效期12个月；冰袋运输
