【产品概述】

RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化可以对结合在复合物上的RNA进行qPCR验证或者测序分析。RIP是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。

【微珠属性】

适用范围  RIP

磁珠浓度  10 mg/mL

磁珠直径  1 μm

适用抗体种属  广谱抗体种属

耐受高温  不耐高温

配基  蛋白A/G

【试剂准备】

裂解液，磁力架，EP管，RNase抑制剂，蛋白酶K，Loading buffer，NT2溶液（50 mM Tris pH7.4，150 mM NaCl，1 mM MgCl₂，Trizol，RNA提取试剂盒等，均需要RNase free试剂。

【使用说明】

以下方案均以1×10⁷个K562细胞为例，用户可根据实验可自行调整。所使用裂解缓冲液和NT2缓冲液均需添加足量RNA酶抑制剂（100U/mL）和蛋白酶抑制剂。

1. 样本裂解

1.1 收集1×10⁷个细胞，加入适量冰冷PBS漂洗两次以彻底去除培养基成分，4°C 300×g 离心5 min。

1.2 加入500 μL预冷的IP裂解缓冲液，吹打混匀。

1.3 置于冰上裂解30 min。

1.4 低温离心4 °C 12000×g，5 min，收集上清至新的无RNase离心管中。取样30 μL作为蛋白input，取样30 μL作为RNA input，-80°C保存。

2 RNA免疫共沉淀

2.1 向上步样本裂解上清液中加入适量抗体（按照抗体说明书添加），放混匀仪上4°C孵育过夜。

2.2 每组实验取25 μL磁珠，加入200 µL裂解缓冲液洗涤磁珠，颠倒混匀，磁分离，弃上清。

2.3 再次加入200 µL裂解缓冲液，颠倒混匀，磁分离，弃上清，保留磁珠。

2.4 将步骤2.1的样本-抗体混合物加入步骤2.3的磁珠中，放混匀仪上4°C翻转孵育2 小时，后磁分离，弃上清。

2.5 加入500 μL裂解缓冲液洗涤，颠倒混匀，磁分离，弃上清；重复漂洗1次。

2.6 再次加入500 μL NT2缓冲液洗涤两次，颠倒混匀，在最后一次洗涤时取100 μL移入新的离心管中用于蛋白检测（标注为管A），剩余400 μL用于RNA提取（标注为管B）；两管分别磁分离，弃上清。

2.7 向管A中加入20 μL 2×Loading buffer，95°C加热10min（蛋白Input加入15μL2×Loading buffer），磁分离，收集上清至新的无RNase离心管中，用于诱饵蛋白的Western Blot检测。

3 蛋白酶K消化

3.1 按以下比例配置好蛋白酶K消化液：100 μL NT2溶液+0.1% SDS+80U RNase抑制剂+30 μg蛋白酶K。

3.2 向管B磁珠和RNA input中分别加入100μL蛋白酶K消化液，55°C孵育30min（不时摇晃，避免磁珠沉底），后磁分离，取上清用于后续的RNA提取纯化步骤。

4 RNA提取纯化

4.1 将上一步所得上清取出，加入1 mL Trizol裂解，按RNA提取试剂盒说明书指示进行RNA提取。

用DNA纯化试剂盒或酚仿抽提法纯化提取其中的ChIP-DNA，可用于qPCR验证或测序等后续实验。

【注意事项】

1 磁珠液pH 值为7-8，严禁冻结。

2 密闭保存，避免干燥，保持微珠浸于储液。

3 本品为悬液，使用前需充分混匀，微珠彻底悬浮后吸取，使用过程中避免高速离心。

4 超声处理会使蛋白A/G磁珠捕获的抗体脱落。

本产品仅供科研使用。