【产品简介】

胶原酶(Collagenase)来源于溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)，是一种蛋白酶，能够特异性的识别Pro-X-Gly-Pro序列并切割该序列中性氨基酸(X)和甘氨酸(Gly)之间的肽键，并且这种序列在胶原中出现的频率很高。胶原酶是唯一的一种可以降解广泛存在于结缔组织中的具有三股螺旋的天然胶原纤维的蛋白酶。

本品为II型胶原酶，≥125 U/mg固体，可用于心脏、甲状腺、唾液腺、肝、骨、软骨等组织和细胞的解离。

【活性定义】

1个酶活力单位指在37°C，pH7.5的条件下，5 h内水解胶原产生1 μmol的L-亮氨酸所需的酶量。

【使用方法】

1 胶原酶储存液的配制

1.1 向每管100 mg的胶原酶中加入1 ml的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS(Hank's平衡盐溶液，含Ca²⁺、Mg²⁺)，轻轻旋涡震荡使其充分溶解，制备成100 mg/ml(即100×)的储存液。用低蛋白结合性的0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装成小份量，于-20°C避光冻存。

1.2 使用前于冰上解冻，避免反复冻融。其用于组织和细胞分散的常用浓度为：0.5-2.5 mg/ml，用于软骨消化的常用浓度为1-2 mg/ml，需要根据特定的实验条件或者参考相应的文献资料确定所需的最佳工作浓度。

2 组织的分离

2.1 使用无菌手术刀或剪刀将组织切成3-4 mm大小的组织块；

2.2 利用含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS洗涤组织块数次；

2.3 加入足量的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS，使其浸没组织块，并加入胶原酶至需要的工作浓度；

2.4 于37°C孵育4-18 h。消化时使用水平摇床以及用3 mM的CaCl₂补充消化可以提高消化效率；

2.5 已分散开的细胞可使用不锈钢或尼龙网筛筛得，收集备用。未完全解离的组织另外添加适量的新鲜胶原酶工作液于37°C继续孵育；

2.6 利用不含胶原酶的HBSS洗涤收集的细胞数次；

2.7 细胞培养液重悬上述细胞，利用自动细胞计数器或其他方法计算活细胞密度；

2.8 于细胞培养皿上利用合适细胞培养基接种细胞。

3 器官灌注

3.1 向37°C预热的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS中加入胶原酶，另添加3 mM的CaCl₂有助于提高分离效率；

3.2 按照已优化的速率对相应的器官灌注胶原酶工作液；

3.3 将上述过程中回收的灌注液流经不锈钢或尼龙网筛，从而将已解离的细胞或小片段组织块与较大团块分离开来，未充分解离的组织需利用新鲜胶原酶工作液于37°C进一步孵育；

3.4 利用不含胶原酶的HBSS洗涤收集的细胞数次；

3.5 细胞培养液重悬上述细胞，利用自动细胞计数器或其他方法计算活细胞密度；

3.6 于细胞培养皿上利用合适细胞培养基接种细胞。

【注意事项】

用于提取原代细胞培养时，本品配制成的溶液需要过滤除菌